用电雾式检测器（CAD）测定糖类、脂质或药用辅料时，校准曲线不一定呈直线。方法验证需要回答的是：所选响应模型能否在预期范围内给出准确、精密、可靠的结果。ICH Q2(R2)第3.2.2节分别讨论线性和非线性响应，为这类方法提供了明确的评价框架。
一、Q2(R2)与Q14在国内的适用时间
国家药监局2024年第65号公告规定，自2024年11月24日起开始的相关研究适用《Q2(R2)：分析方法验证》和《Q14：分析方法开发》，研究起始时间以试验记录时间为准。申请人应在现行药学研究技术要求基础上开展相应研究。公告也说明，Q14可采用基础方式、增强方式，或部分采用增强方式。
对实验室而言，应先明确方法的用途：原料药含量、制剂含量、有关物质或其他定量项目，对范围、专属性和低端性能的要求并不相同。不要把一种产品的验证设计直接复制到另一种基质。
二、非线性响应可以建模，但验证不止看R²
Q2(R2)第3.2.2.2节指出，出现非线性响应时，应通过模型或函数描述浓度（或活性）与响应的关系，并评价模型适用性。浓度与响应本身无需强行保持直线关系，方法在给定范围内的结果仍应与真实或已知值相符。
对于CAD，可根据实际数据比较幂函数、适当的多项式或经验证的信号转换。高R²不能代替准确度和精密度证据：低浓度端的回算偏差、基质影响、不同日期的稳定性，都可能被一个漂亮的相关系数掩盖。
三、报告范围和工作范围要分开写
报告范围对应最终报告结果的区间，通常与质量标准使用相同单位；工作范围对应实际呈递给仪器测量的浓度或质量属性区间。样品稀释、称样量和计算公式会把两者联系起来，两者也可能相同。
| 常见用途 | Q2(R2)表2中的推荐示例 | CAD开发时要确认 |
|---|---|---|
| 含量测定 | 标示量的80%–120%；按质量标准确定时，下端可为下限的80%，上端为上限的120% | 将报告范围换算为进样溶液的工作范围，并验证模型 |
| 含量均匀度 | 通常为标示量的70%–130%，某些剂型或情况可能需要更宽范围 | 样品前处理和稀释是否覆盖预期结果 |
| 杂质定量 | 报告限至质量标准限度的120% | 定量限不高于报告限，低端准确度和精密度可接受 |
这些是推荐示例，其他范围可在充分论证后采用。报告范围是80%–120%，并不证明CAD在相应工作范围内必然线性，是否可以使用直线必须由实验评价。
四、三种校准路线，怎样选择？
1. 在原始响应尺度直接建立模型
可先比较适合数据的幂函数或多项式模型，固定截距处理、拟合算法和权重。幂函数在原始尺度直接拟合，与先做双对数回归再反变换，具有不同的误差假设，所得参数和回算偏差可能不同，不能简单视作同一种处理。
2. 在支持的检测器或数据系统中进行信号转换
部分CAD平台提供幂函数值（PFV）等转换设置。使用前应确认具体设备和软件是否支持，并验证转换后结果。PFV属于方法参数，应记录设置、软件版本和数据处理方式。本文不推定SparkFlux2000具有其他品牌平台的PFV功能。
3. 在经验证的窄工作范围采用线性模型
如果残差、回算偏差和独立样品结果表明线性模型适用，可以限定范围使用。若方法同时承担低含量杂质测定，则需要重新评价低端性能和更宽范围，而不能直接沿用主成分附近的直线。
五、浓度点和加权方式，应由什么决定？
Q2(R2)对线性评价推荐至少5个合理分布的浓度。非线性响应章节没有规定通用的浓度点数下限。作为开发建议，可先用6–8个覆盖预期工作范围的浓度开展比较，并根据模型复杂度、重复测定结果及低端风险调整设计；这不是法规统一规定。
- 检查残差：是否在低端、高端或中段出现持续的正偏或负偏。
- 检查回算偏差：各浓度回算结果是否符合预先设定的标准。
- 比较权重：不加权、1/x和1/x²等会改变不同浓度的贡献，应依据误差分布及验证样品结果选择。
- 使用独立验证样品：仅回算建模用的校准点，不能替代独立的准确度评价。
- 限制模型复杂度：新增参数应有科学理由，避免通过高阶曲线掩盖异常点或样品制备问题。
阿米卡星的公开CAD研究采用过1/x²加权，这是特定方法的选择依据，不能作为所有CAD项目的默认设置。相关实例可参考氨基糖苷类HPLC-CAD方法开发要点。
六、CAD方法还需关注哪些验证内容？
- 专属性与选择性：CAD可响应许多非挥发性及部分半挥发性组分。应评价稀释液、辅料、反离子和系统残留干扰，必要时结合正交方法；LC-MS峰归属不能自动证明CAD峰没有共洗脱。
- 准确度和精密度：覆盖预期范围，尤其关注低端。Q2(R2)也允许有依据的合并评价方式，例如预测区间或容忍区间。
- 定量限：估算得到的QL应以接近该水平的样品确认；也可直接通过低端准确度和精密度验证。非线性曲线不宜机械套用单一线性斜率计算QL。
- 耐用性：按风险考察流动相比例与纯度、梯度、蒸发条件、气源、滤波和采集设置，以及实际采用的信号转换。
- 生命周期管理：更换检测器、调整模型或权重后，应评价影响并确定必要的部分或完整再验证范围。
七、验证方案可以按这七项整理
- 预期用途、质量属性和预先设定的性能接受标准。
- 报告范围、仪器工作范围，以及两者之间的稀释和计算关系。
- 校准模型、拟合算法、权重、截距和异常数据处理规则。
- 浓度点、重复设计、残差及回算偏差评价方法。
- 独立样品准确度、精密度与低端确认设计。
- 检测器关键设置、系统适用性和日常质量控制。
- 开发数据引用依据及后续变更管理要求。
1. 国家药监局2024年第65号公告（上海市药监局转载）。
2. ICH Q2(R2)：分析方法验证，EMA公开版本，重点参见2.3、3.2.1、3.2.2和3.2.3节。
3. Soliven A. et al., 阿米卡星CAD方法开发与验证，DOI: 10.1016/j.jpba.2017.05.013。本文为技术解读，具体应用以正式指导原则、现行药典及项目要求为准。
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