肝素、硫酸软骨素、透明质酸这些糖胺聚糖(GAG),是一类硫酸化或酸性多糖,共同特点是没有紫外吸收,UV测不了。它们的含量和单糖/二糖组成,常用亲水作用色谱配电雾式检测器(HILIC-CAD)。不过有一点要先说清:肝素最有名的OSCS掺假安全鉴别,主力是核磁、毛细管电泳和质谱,不是CAD——这篇把GAG的CAD定量、和掺假鉴别的分工讲明白。
一、糖胺聚糖为什么UV测不了？
肝素、硫酸软骨素、透明质酸都是由糖醛酸和氨基糖交替连成的长链多糖,链上带硫酸基或羧基。它们缺少共轭发色团,在常用紫外波长下几乎不吸收,UV检测器看不到。要测含量和组成,得用不依赖发色团的通用检测器——这正是CAD的位置。
二、HILIC-CAD测GAG的含量与二糖组成
GAG的常规做法是先把多糖酶解或降解成二糖,再用HILIC或离子对色谱分离、CAD检测,不衍生就能定量各二糖单元,据此评价含量、纯度和组成。这套思路和玻尿酸的单糖组成分析同源(见 玻尿酸怎么检测),对肝素、硫酸软骨素、透明质酸都适用。CAD灵敏度和梯度兼容性优于示差折光(RID)和传统显色法。
三、要说实话:OSCS掺假鉴别,不归CAD
肝素史上最著名的质量事件是2008年的OSCS掺假:肝素被过硫酸软骨素(OSCS)掺假,引发严重不良事件,而当时的常规方法没能识别出来。此后行业建立了多套鉴别手段:
- 核磁共振(NMR):多维NMR识别OSCS特征信号;
- 毛细管电泳(CE):分离带电多糖;
- 强阴离子交换HPLC(SAX-HPLC):按电荷分离;
- HILIC-质谱(HILIC-MS):可检出低至0.1%的OSCS。
四、制备液相:GAG寡糖的分离纯化
研究GAG的结构和活性,常要把降解得到的寡糖分离出来。用制备级液相把特定长度或结构的寡糖切出、纯化,可用于结构研究或做对照品。维科特瑞自研的 WKPrep 高压制备液相 可用于此,无紫外寡糖的切峰配CAD完成。
五、国产替代:多糖生物药分析的国产组合
GAG的含量与二糖组成定量,核心是HILIC或离子对色谱配CAD,这块国产能接住。瓴峰 SparkFlux2000 电雾式检测器(CAD)动态范围4个数量级、蒸发温度室温+5℃~100℃可调、重复性RSD≤1%,可对接岛津、安捷伦、沃特世等主流液相,做肝素、硫酸软骨素、透明质酸的含量与组成定量;其核心荷电技术(直接电晕荷电DCCM)相关研究成果发表在ACS《Analytical Chemistry》上。配WKPrep制备液相做寡糖纯化,就是一套面向多糖生物药的国产分析组合。掺假安全鉴别仍建议配NMR/CE/质谱。
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Q：肝素怎么测含量和组成？
A：肝素无紫外吸收,把多糖降解成二糖后,用HILIC或离子对色谱配CAD不衍生定量各二糖单元,评价含量与组成。
Q：OSCS掺假用CAD能查出来吗？
A：不以CAD为主。OSCS掺假鉴别主要用NMR、毛细管电泳、强阴离子交换HPLC和HILIC-质谱(可检出低至0.1%OSCS);CAD负责本体含量与组成定量,两者分工。
Q：硫酸软骨素、透明质酸也能用这套方法吗？
A：能。它们和肝素同属糖胺聚糖、都无紫外吸收,二糖或单糖组成分析都可用HILIC-CAD。
Q：GAG寡糖怎么分离纯化？
A：用制备液相(如WKPrep)把降解得到的寡糖按长度或结构切出、纯化,用于结构研究或制备对照品,切峰配CAD检测无紫外寡糖。